球体怎么染色， 构建成球后染色成了最头疼的问题
细胞用了一堆
培养基用了几套
染的头都大了，也没染个自己满意的出来
按照下面步鄹1.2.3 ，轻松搞定干细胞球体染色

一、固定

1.使用宽口径移液器枪头轻轻收集球体，并转移到1.5 mL离心管中。让球体沉淀，然后小心吸出上清液。

备注： 用PBS中的1%BSA预先涂覆尖端和离心管可能有助于确保最大的转移效率。

2. 室温下将球体放入4% 多聚甲醛 (PFA) 中固定 15-20 分钟，然后用50mM Tris/HCl (pH7.4) 淬灭 30分钟。根据球体的大小，较大的球体可能需要更长的固定时间。

3. 固定后，用PBS清洗球体3次（每次清洗5分钟）。

备注：细胞可以在 4°C 下长期保存（>1 年）。

二、 通透性

1. 将球体在室温下与 PBS 中的 0.1-1.0% Triton X-100（或其他透化剂）一起孵育3小时。根据球体密度和要染色的分子大小调整透化时间。

2. 再次用 PBS 清洗球体（清洗3次，每次5分钟）。

三、 封片

1. 将球体在封闭缓冲液（例如 PBS 中的 1% BSA 和 1% 驴血清）中在室温下孵育 1 小时，以减少非特异性染色。

2. 提示：使用产生二抗的动物血清可以降低背景。

3. 注意：BSA 通常适用于阻断步骤，但如果背景噪音较大，则需要进行经验测试以获得给定抗体组合的最佳结果。

4. 在孵育过程中轻轻搅拌或摇动以确保封闭缓冲液均匀分布。

四、染色

1. 制备用 PBS 和封闭缓冲液稀释的染色溶液（例如，一抗、核染料或荧光探针）。

2. 将球体在染色溶液中孵育 24-72 小时，温度为 4°C。长时间孵育可确保染色剂到达球体最内层的细胞。

3. 或者，保持球体处于温和搅拌下（例如，在摇杆或旋转平台上）以增强渗透。

五、洗涤

1. 用 PBS 清洗球体 3-5 次，以去除未结合的污渍。确保清洗动作轻柔，以保持球体的完整性。

六、 复染

1. 如果需要二抗或复染（例如，用于检测一抗或染色其他标记物），则将球体与二抗染色溶液在 24°C 下再孵育 48-4 小时。

2. 添加 Hoechst 33342 并在 2 °C 下再孵育 4 小时

3. 再用 PBS 清洗 3-5 次。

4. 注意：该协议可以在这里暂停，并且样品可以在 4°C 下避光保存数月。

七、拍照

1. 将染色的球体转移到玻璃载玻片或成像室中，并使用专为 3D 成像设计的封固剂。确保封固剂与您的成像方法兼容，并尽量减少自发荧光。

2. 使用共聚焦、光片或双光子显微镜对染色的球体进行成像，以获得最佳可视化效果。确保采集设置（Z 堆叠、激光功率）针对 3D 样本进行调整。

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